Simone Dias Franco
Em 16 de abril de 2019, Simone Dias Franco, aluna de mestrado do programa de Pós-Graduação em Biodiversidade Vegetal e Meio Ambiente do Instituto de Botânica – SP., bolsista CNPq, defendeu sua Dissertação de Mestrado intitulada, “Bidens segetum Mart. Ex Colla: isolamento e identificação dos poliacetilenos com atividade antifúngica (gênero Cladosporium) e polifenóis com atividade antioxidante do extrato etanólico de folhas.”
A banca examinadora foi presidida pela sua orientadora, PqC. Dr.ª Luce Maria Brandão Torres e composta pela Prof.ª Dr.ª Fabiana Henriques Machado de Melo (FCMSCSP) e pela PqC. Dr.ª Silvia Ribeiro de Souza (Núcleo de Pesquisa em Ecologia – IBt/SP).
Bidens segetum Mart. Ex Colla: isolamento e identificação dos poliacetilenos com atividade antifúngica (gênero Cladosporium) e polifenóis com atividade antioxidante do extrato etanólico de folhas
ABSTRACT
Bidens segetum Mart. ex Colla (Asteraceae) is popularly known as “picão do mato”, an herbaceous plant that occurs in the Cerrado biome of some Brazilian states. Bidens species are used in folk medicine, many of which have already been studied. The activities attributed to these plants are related to secondary metabolites or natural products, which are synthesized to perform primary ecological functions, responsible for interactions with the environment, protection against ultraviolet rays (UV), pollination and may have their synthesis altered as a function of their characteristics environmental conditions. Among the secondary metabolites reported in the literature for the genus Bidens are polyphenols and polyacetylenes. The objective of the present work was to isolate, purify and identify polyacetylenes with antifungal activity and polyphenols with antioxidant activity from the fractions obtained from B. segetum ethanolic extract. The fresh leaves were collected from B. segetum specimens grown at the Núcleo de Pesquisa de Fisiologia e Bioquímica from Instituto de Botânica de São Paulo, SP (IBt, SP). The leaves were weighed, frozen, lyophilized, crushed and macerated with ethanol (93°) for three days to obtain crude extract (EEBs). The monitored fractionation methods were performed with EEBs. The former by exclusion chromatography (Sephadex LH-20) on an open top column and gradient with the eluents hexane (Hex), ethyl acetate (AcOEt), methanol (MeOH) and H2O and the second by liquid-funnel partition glass, with Hex, AcOEt and H2O. The evaluation of antioxidant potential was based on the qualitative assay on CCD, silica gel and quercetin as standard and quantitative on microplate and chlorogenic acid as standard, both using the DPPH free radical assay. To evaluate antifungal activity, CCD bioautographs were performed and the detection limit was determined with the filamentous fungi Cladosporium sphaerospermum and Cladosporium cladosporioides and nystatin as standard. To optimize the extraction method of polyacetylenes responsible for antifungal activity, extracts were obtained with frozen and lyophilized fresh leaves and dried leaves (60 ºC) by dichloromethane (DCM) and AcEOt immersions and the chromatographic profiles of the extracts (HPLC-DAD) showed whereas fresh, frozen and lyophilized leaves are a good matrix for the study of polyacetylenes present in the superficial part of the leaves. The phytochemical study was performed by CCD using class specific metabolite developers, especially for phenolic compounds such as flavonoids (NP – PEG), high performance liquid chromatography (HPLC) on analytical and semi-preparative scale and detection in the ultraviolet region (UV) and mass spectrometry (MS / MS), preparative layer (CCDP, silica gel) and open-top column chromatography using reverse phase (C18) and uni (1HNMR) and two-dimensional (HSQC, HMBC) nuclear magnetic resonance). The subfractions PP4 and PFFR3.3 were obtained from successive EEBs fractionations, CCDP purification and semi-preparative high-performance liquid chromatography and showed the best results for purity (HPLC-DAD) and activity in antifungal assays (Cladosporium) and anti-radical (DPPH) respectively. Analysis data showed that the PFFR3.3 subfraction is rich in 5-CGA, similar to the standard (5-O-E-caffeoylquinic). For PP4 subfraction with antifungal activity (10 µg, C. sphaerospermum), polyacetylenes (LC-DAD / MS / MS) were identified at retention times of Tr = 17.7 min (C22H26O8) at / z = 419 Da [M + H +] in glycosylated form and another at Tr = 22.6 min (C31H34O10) of m / z = 567 Da [M + H +] esterified with the 2-O-cafeoyl-2-methyl-D-erythonic acid derivative. PP4, PFFR3.3 and chlorogenic acid (5-CGA) at various concentrations were evaluated in in vitro assays at different times (5, 15 and 30 min) with melanocyte cells (NGM) and radial growth melanoma strains. (Wm 1552), vertical growth (Wm 1366) and metastatic growth (Lu 1205) which quantify superoxide anion production based on the oxidation of DHE (dihydroethidium) probe molecule. The results showed that there was no decrease in superoxide anion (O2–) levels compared to control, that is, no inhibition of superoxide anion production was observed in melanocyte (NGM) cells and melanoma strains tested in PP4 subfractions. PFFR3.3 and 5-CGA standard.
Keywords: Asteraceae, Anti-radical activity, Antioxidant activity, Phenolic compounds, Polyacetylenes
RESUMO
Bidens segetum Mart. ex Colla (Asteraceae) é popularmente conhecida como “picão do mato”, uma planta herbácea que ocorre no bioma Cerrado de alguns estados brasileiros. As espécies de Bidens são usadas na medicina popular, muitas das quais já foram estudadas. As atividades atribuídas a estas plantas estão relacionadas aos metabólitos secundários ou produtos naturais, que são sintetizados para desempenhar funções ecológicas primárias, responsáveis pelas interações com o meio ambiente, proteção contra raios ultravioleta (UV), polinização e podem ter sua síntese alterada em função das condições ambientais. Entre os metabólitos secundários, relatados na literatura para o gênero Bidens estão os polifenóis e os poliacetilenos. O objetivo do presente trabalho foi isolar, purificar e identificar os poliacetilenos com atividade antifúngica e os polifenóis com atividade antioxidante das frações obtidas do extrato etanólico de B. segetum. As folhas frescas foram coletadas de espécimes de B. segetum cultivadas no Núcleo de Pesquisa em Fisiologia e Bioquímica do Instituto de Botânica de São Paulo, SP (IBt, SP). As folhas foram pesadas, congeladas, liofilizadas, trituradas e maceradas com etanol (93o) por três dias, obtendo-se o extrato bruto (EEBs). Os métodos de fracionamentos monitorados foram realizados com EEBs. O primeiro por cromatografia de exclusão (Sephadex LH-20) em coluna de topo aberto e gradiente com os eluentes hexano (Hex), acetato de etila (AcOEt), metanol (MeOH) e H2O e o segundo por partição liquído-liquído em funil de vidro, com Hex, AcOEt e H2O. A avaliação do potencial antioxidante baseou-se no ensaio qualitativo em CCD, sílica gel e quercetina como padrão e quantitativo em microplaca e ácido clorogênico como padrão, ambos utilizando o ensaio do radical livre DPPH. Para avaliar a atividade antifúngica foram realizadas bioautografias em CCD e a determinação do limite de detecção com os fungos filamentosos Cladosporium sphaerospermum e Cladosporium cladosporioides e nistatina como padrão. Para otimizar o método de extração de poliacetilenos responsáveis pela atividade antifúngica, extratos foram obtidos com folhas frescas congeladas e liofilizadas e folhas secas (60 ºC) por imersões em diclorometano (DCM) e AcEOt e os perfis cromatográficos dos extratos (HPLC-DAD) mostraram que folhas frescas, congeladas e liofilizadas constituem uma boa matriz para o estudo de poliacetilenos, presentes na parte superficial das folhas. O estudo fitoquímico foi realizado por CCD utilizando reveladores específicos para as classes de metabólitos, especialmente para compostos fenólicos, como flavonoides (NP – PEG), cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) em escala analítica e semi-preparativa e detecção na região do ultravioleta (UV) e espectrometria de massas (EM/EM), cromatografia líquida em camada preparativa (CCDP, sílica gel) e em coluna de topo aberto usando fase reversa (C18) e ressonância magnética nuclear uni (1HNMR) e bidimensionais (HSQC, HMBC). As subfrações PP4 e PFFR3.3 foram obtidas dos sucessivos fracionamentos de EEBs, purificação em CCDP e cromatografia líquida de alta eficiência em escala semi-preparativa e apresentaram os melhores resultados para grau de pureza (CLAE-DAD) e atividade em ensaios antifúngicos (Cladosporium) e anti-radicalar (DPPH) respectivamente. Os dados das análises mostraram que a subfração PFFR3.3 é rica em 5-CGA, similar ao padrão (5-O-E-cafeoilquínico). Para a subfração PP4 com atividade antifúngica (10 µg, C. sphaerospermum), foram identificados poliacetilenos (LC-DAD/EM/EM) nos tempos de retenção de Tr=17.7 min (C22H26O8) e m/z = 419 Da [M+H+] na forma glicosilada e outro no Tr=22.6 min (C31H34O10) de m/z = 567 Da [M+H+] esterificado com o derivado do ácido 2-O-cafeoil-2-metil-D-eritônico. A PP4, PFFR3.3 e o ácido clorogênico (5-CGA) em várias concentrações foram avaliados nos ensaios in vitro, em diferentes tempos (5, 15 e 30 min) com células de melanócitos (NGM) e linhagens de melanoma de crescimento radial (Wm 1552), crescimento vertical (Wm 1366) e crescimento metastático (Lu 1205) que quantificam a produção de ânion superóxido, com base na oxidação de DHE (dihidroetídio), molécula sonda. Os resultados mostraram que não houve diminuição dos níveis de ânion superóxido (O2–), em relação ao controle, ou seja, não foi observado inibição na produção de ânion superóxido em células de melanócito (NGM) e linhagens de melanoma testadas nas subfrações PP4, PFFR3.3 e padrão 5-CGA.
Palavras-chave: Asteraceae, Atividade anti-radicalar, Atividade antioxidante, Compostos fenólicos, Poliacetilenos
Simone Dias Franco
Bidens segetum Mart. Ex Colla: isolamento e identificação dos poliacetilenos com atividade antifúngica (gênero Cladosporium) e polifenóis com atividade antioxidante do
extrato etanólico de folhas
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