Levi Pompermayer Machado
O aluno Levi Pompermayer Machado obteve o Título de Doutor pelo Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade Vegetal e
Meio Ambiente do Instituto de Botânica de São Paulo (IBt/SP), em 29 de julho de 2014. Sua tese, intitulada:
Determinação dos metabolitos com atividade antifúngica e cultivo em biorreatores para obtenção de bioativos de Ochtodes secundiramea e
de linhagens pigmentares de Hypnea musciformis ( Rhodophyta)
contou com a orientação da Dra. Nair Sumie Yokoya (IBt/SP) e com a co-orientação do Dr. Pio Colepicolo (USP).
A tese foi avaliada pela banca examinadora composta pela: Prof. Dra. Yocie Yoneshigue Valentin (UFRJ), Prof. Dra. Hosana Maria Debonsi (USP),
Prof. Dr. Ernani Pinto (USP) e pelo Prof. Dr. Danilo da Cruz Centeno (UFabc).
O projeto se propôs a determinar para Ochtodes secundiramea e das linhagens pigmentares de
H. musciformis os metabolitos com atividade antifúngica para o controle de fungos fitopatogênicos causadores da antracnose.
Após a determinação das moléculas foi realizado o cultivo das macroalgas em biorreatores objetivando aumento no rendimento para a obtenção dos bioativos.
Determinação dos metabolitos com atividade antifúngica e cultivo em biorreatores para obtenção de bioativos de Ochtodes secundiramea e de linhagens pigmentares de Hypnea musciformis ( Rhodophyta)
RESUMO
A macroalga Ochtodes secundiramea (Montagne) M.A. Howe (Rhodophyta, Gigartinales) e as linhagens pigmentares de Hypnea musciformis (Wulfen) J.V. Lamouroux (Rhodophyta, Gigartinales) apresentam expressivo potencial biotecnológico, principalmente no que se refere à aplicação de seus extratos (ricos em monoterpenos halogenados e esteróis, ácidos graxos e gliceróis, respectivamente) na inibição do crescimento de fungos do gênero Colletotrichum. Esses fungos fitopatógenos causam antracnose em frutas e por isso, promovem perdas significativas ao agronegócio. Para isso, os objetivos do presente estudo foram: (1) realizar o fracionamento bioguiado e determinar as substâncias bioativas dos extratos das linhagens de cor de H. musciformis e O. secundiramea, que possuem potencial antifúngico para controle de fungos fitopatogênicos in vitro e in vivo, avaliando adicionalmente o efeito do uso de biomassa fresca, liofilizada e seca na bioatividade e composição dos extratos; (2) verificar a influência do enriquecimento por CO2 para as linhagens de H. musciformis e de KBr para O. secundiramea em cultivos realizados em biorreatores, avaliando a fisiologia das macroalgas e a produção dos metabolitos de interesse e (3) Avaliar o efeito, no desenvolvimento da antracnose e no amadurecimento de frutos de mamão em resposta a aplicação de biofilme contendo os bioativos de macroalgas. A utilização da biomassa de alga fresca permitiu maior rendimento na obtenção de extratos das linhagens de H. musciformis, e a atividade antifúngica e o perfil em cromatografia gasosa/espectrometria de massas (CG/EM) não foi alterado. Está análise revelou que o extrato da linhagem marrom (MA) de H. musciformis apresentou uma quantidade menor de substâncias e de manchas bioativas do que a linhagem verde clara (VC) na bioautografia qualitativa. O limite de detecção (LD) foi 100 µg para os extratos das duas linhagens, sendo considerada uma fraca atividade antifúngica. Para O. secundiramea, não houve diferença no rendimento de extração, no entanto, foi observado a formação de monoterpenos oxidados nos tratamentos com biomassa liofilizada e seca, associado com o aparecimento de manchas de atividade antifúngica em bioautografia por cromatografia em camada delgada (CCD). Após o fracionamento bioguiado por CCD preparativa, a análise por cromatografia líquida de alta eficiência/espectrometria de massas de alta resolução (CLAE/EM) revelou a presença de esteróis-glicosilados, compostos derivados de colesterol associados à galacto ou glicopiranosil e ácidos graxos. Análise por CG/EM do extrato e da fração bioativade O. secundiramea indicou a presença de diversos monoterpenos halogenados, e após cromatografia em coluna foram isoladas sub-frações e as avaliações em CG/EM e ressonância magnética nuclear (RMN) confirmaram a presença dos monoterpenos C10H13Br3Cl e C10H15Br2Cl e indicaram a presença dos terpenos C10H12OBr2, C10H14Br2 e C10H14BrCl. Estas sub-frações apresentaram o mesmo limite de detecção (1 µg) que o extrato da FBCCD. A aplicação dos biofilmes de amido contento extrato ou FBCCD na concentração de 10 µg.mL-1, valor da concentração inibitória mínima contra o crescimento de Colletotrichum gloeosporioides (determinada pelo método da difusão em ágar), inibiram o desenvolvimento da antracnose pós-colheita e não causaram sintomas de toxicidade no fruto, no experimento simulando o período de prateleira do mamão. O cultivo em biorreatores com enriquecimento por CO2 não afetou o crescimento e as concentrações de pigmentos fotossintetizantes, proteínas e açúcares totais das linhagens de H. musciformis, no entanto, foi observada a síntese de diferentes esteróis-glicosilados relacionados como aparecimento de manchas antifúngicas no extrato da linhagem MA. O enriquecimento do meio com bromo, no cultivo de O. secundiramea, causou aumento de 50% na concentração e na atividade da enzima bromoperoxidase, o que promoveu aumento equivalente na remoção do bromo do meio e na sua incorporação ao talo da alga. Este tratamento causou também aumento nas concentrações de pigmentos e de proteínas associadas à proteção, promovida pela enzima, contra estresse oxidativo, e não foram observadas alterações no perfil dos monoterpenos oxigenados em resposta ao tratamento. Os resultados permitiram de linear as seguintes conclusões: (1) os monoterpenos halogenados de O. secundiramea apresentaram elevado potencial antifúngico para aplicação do controle da antracnose; (2) Indicação da presença de esteróis – glicosilados na fração bioativa das linhagens de H. musciformis, sendo que a linhagem VC apresentou maior diversidade química e potencial antifúngico do que a linhagem MA; (3) a manipulação de parâmetros abióticos nos cultivos em biorreatores possibilitaram a obtenção de biomassa e dos metabolitos bioativos das espécies estudadas; e (4) O extrato e a FBCCD de O. secundiramea, aplicados juntamente como biofilme de amido, foram eficazes na inibição da antracnose pós-colheita do mamão, sem causar sintomas de fitotoxicidade.
Palavras chaves: Monoterpenos halogenados, Esteróis glicosilados, Ochtodes secundiramea, linhagens de Hypena musciformis, Fungos fitopatógenos, Antracnose.
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