Angelica Nunes Garcia
No dia 30 de abril de 2014, a aluna do Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade Vegetal e Meio Ambiente do Instituto de Botânica (IBt),
Angelica Nunes Garcia (Bolsista CAPES), defendeu sua dissertação de mestrado intitulada
“Estudo químico e de toxicidade subcrônica da cianobactéria Pseudanabaena galeata”.
O trabalho foi orientado pela Dra. Luciana Retz de Carvalho, do Núcleo de Pesquisa em Ficologia do Instituto de Botânica.
A banca examinadora foi composta pela Dra. Luciana Retz de Carvalho,
Dra. Luciana Castro da Cunha (FMU) e Dra. Luce Maria Brandão Torres (IBt).
Pseudanabaena galeata CCIBt3082 coletada no lago do IAG, situado no Parque Estadual das Fontes do Ipiranga (PEFI), em São Paulo, Brasil era produtora de cianotoxina letal desconhecida. Para avaliar seu potencial risco para mamíferos, associado à exposição oral, esta cepa – que havia sido mantida em cultura desde 1996 – foi submetida a estudos toxicológicos in vitro e in vivo. Os resultados mostraram diminuição/perda da atividade tóxica. A toxicidade do princípio ativo de P. galeata diminuiu no decorrer do tempo, pois a dose letal aguda média para camundongos cresceu de 1.000 mg kg-1 p.c. para 5.000 mg kg-1. No teste subcrônico oral (período de 28 dias) não houve variação no peso dos animais e dos seus órgãos (fígado, rins, baço e timo) e, nos correspondentes estudos post-mortem, não foram observadas macro e micro lesões nos órgãos, com exceção de dilatações císticas no topo das vilosidades no intestino, devidas possivelmente a dilatações de vasos linfáticos. Essas alterações podem ser atribuídas a um leve processo inflamatório, na região. Nossos resultados são distintos dos encontrados na literatura, que descrevem P. galeata como produtora de potente toxina. A perda de características morfológicas e bioquímicas, que têm sido frequentemente observadas em cianobactérias e bactérias mantidas em cultura, são associadas, atualmente, a variações no tamanho de seu genoma, pois a evolução de um micro-organismo é, na maioria das vezes, condicionado por seu estilo de vida. Esses processos adaptativos podem levar à perda de genes acessórios e consequentemente a mudanças morfológicas e bioquímicas.
Estudo químico e de toxicidade subcrônica da cianobactéria Pseudanabaena galeata
RESUMO
As cianobactérias são organismos procariontes fotossintetizantes, com grande importância ecológica, integrantes do fitoplâncton dos corpos de águas doces e salgadas, em todo o mundo. Uma de suas características mais importantes é a produção de metabolitos tóxicos, as cianotoxinas, cuja presença em reservatórios de abastecimento, em água utilizada em processos de diálise e ainda acumuladas em glândulas e tecidos de mariscos e peixes foi responsável por inúmeros casos de intoxicação e de morte de seres humanos e de animais. O Núcleo de Pesquisa em Ficologia do Instituto de Botânica dedica-se ao estudo de vários aspectos destes organismos, sendo um deles a avaliação das atividades biológicas dos extratos das cianobactérias que compõem a Coleção de Cultura de Cianobactérias do Instituto de Botânica. Nessas pesquisas, foram encontradas cepas causadoras de efeitos tóxicos importantes: Pseudanabaena galeata (CCIBt 3082), que está entre essas linhagens tóxicas, foi escolhida para investigação toxicológica e química, devido aos efeitos nocivos que pode acarretar a animais, por administração oral e intraperitoneal. Tendo-se em conta o risco que a(s) substância(s) ativa(s) presente(s) em P. galeata pode(m) representar e à inexistência de conhecimentos sobre seus efeitos tóxicos, produzidos pela exposição prolongada sobre mamíferos, nossa proposta consistiu na caracterização química e toxicológica (exposição prolongada, administração por via oral) da fração ativa do extrato da cepa Pseudanabaena galeata CCIBt 3082 (Cyanobacteria, Pseudanabaenales). Para tanto, a cepa Pseudanabaena galeata CCIBt 3082, coletada no Parque Estadual das Fontes do Ipiranga, em São Paulo, no dia 01/11/1996 e mantida na Coleção de Culturas de Cianobactérias do Núcleo de Pesquisas em Ficologia do Instituto de Botânica de São Paulo, foi cultivada, em dois “batches” distintos, sob condições controladas de temperatura e irradiância. Cada uma a sua vez, as biomassas, obtidas na fase exponencial de crescimento da cepa, foram liofilizadas, pesadas, submetidas à extração com ácido acético 0,1 M, por exposição a ultrassom, seguida por centrifugação. Os sobrenadantes foram reunidos, liofilizados e pesados. A biomassa resultante do processamento do primeiro “batch” foi empregada no ensaio preliminar de toxicidade em camundongos, por via oral, dose única e no ensaio de toxicidade subcrônica, 28 dias. A biomassa resultante do segundo “batch” foi divida em duas porções. Com a primeira delas foram realizados os seguintes estudos químicos: teste cromatográfico, por Cromatografia Planar, para detecção de microcistinas, saxitoxinas, antoxina-a e β-metilaminoalanina; fracionamento e refracionamento do extrato em ácido acético 0,1 M; análise do extrato, da Fração 1 e da subfração 1.a, por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência e análise do mesmo extrato e da subfração 1.a, por Cromatografia Planar, para pesquisa de aminoácidos, aminas, alcaloides, peptídeos e terpenoides. Com a outra porção, foram realizados estudos biológicos “in vitro” e “in vivo”. Os estudos “in vitro” consistiram em ensaios bioautográficos para análise do potencial antifúngico, das atividades antioxidante e da inibidora da enzima aceticolinesterase. Os estudos “in vivo” consistiram dos ensaios, em camundongo, 1) da toxicidade aguda (dose única), por via intraperitoneal e 2) da toxicidade oral aguda (DL50) e 3) da toxicidade subcrônica, 28 dias. O extrato obtido do primeiro “batch”, no ensaio preliminar de toxicidade em camundongos, por via oral, dose única, causou sinais de intoxicação e lesões no fígado e rins dos animais; no ensaio de toxicidade subcrônica 28 dias, efetuado com doses muito baixas (1, 5 e 25 mg kg-1), os animais apresentaram apenas tendência de perda de peso. No extrato obtido do segundo “batch” não foram detectadas, por Cromatografia Planar, microcistinas, saxitoxinas, anatoxina-a ou β-metilaminoalanina. O fracionamento e refracionamento do extrato em ácido acético (em cartucho de sílica octadecilsilanizada) resultaram no isolamento de substância com natureza peptídica. Os estudos biológicos “in vitro” apresentaram resultados negativos para a presença de substâncias com atividade antifúngica, anticolinesterásica e antioxidante. Já nos estudos biológicos “in vivo”, no ensaio de toxicidade aguda (dose única), por via intraperitoneal, o extrato causou congestão hepática; a (DL50), por via oral foi de 5.000 mg kg-1, e no exame “post-mortem” foi observado fígado congesto. No ensaio de toxicidade subcrônica, os animais apresentaram tendência de perda de peso e nos estudos histopatológicos do intestino, dilatação cística no topo das vilosidades, devido à dilatação dos vasos linfáticos. A comparação entre as doses únicas, por via oral, que levaram os animais a óbito, relativas aos experimentos realizados com biomassa do primeiro e do segundo “batch” (1.000 mg kg-1– 5.000 mg kg-1) mostra disparidade entre os efeitos tóxicos de ambos. Levando-se em conta que logo após o cultivo do segundo “batch”, a amostra da cepa P. galeata CCIBt 3082 entrou em senescência e em lise, essas observações indicam mudanças bioquímicas na linhagem, quadro já descrito para outros organismos, na literatura.
Palavras-chave: Cyanobacteria, toxicidade aguda, mudanças em cultivo.
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