Camila Ranzatto Dogo
No dia 23 de março de 2010, a aluna do Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade Vegetal e Meio Ambiente do Instituto de Botânica de São Paulo, Camila Ranzatto Dogo (Bolsista CAPES), defendeu sua dissertação de mestrado intitulada
“Caracterização dos efeitos tóxicos da fração ativa da cepa CCIBt 920 Geitlerinema amphibium (Cyanophyceae, Oscillatoriales)
na microcirculação e em fibras musculares: análise por microscopia intravital”.
A banca examinadora foi composta pelo Dr. João Sarkis Yunes (UFRS), Dra. Luciana Retz de Carvalho (Orientadora/IBt) e Dra. Carla Lima (IBu). A dissertação consta de estudos realizados por microscopia intravital, técnica que permite a observação “in vivo” da microcirculação sanguínea, os quais, aliados às análises de migração celular e à dosagem de citocinas, indicaram que o extrato metanólico de G. amphibium possui atividade pró-inflamatória. As análises histopatológicas corroboraram as observações feitas através da microscopia intravital, confirmando que o óbito dos animais intoxicados por este extrato ocorre devido a danos circulatórios. O fracionamento químico desse mesmo extrato, monitorado por microscopia intravital, mostrou que nele existem quatro frações com efeito pró-inflamatório e que provavelmente há sinergismo entre elas.
CARACTERIZAÇÃO DOS EFEITOS TÓXICOS DA FRAÇÃO ATIVA DA CEPA SPC 920 Geitlerinema amphibium (CYANOPHYCEAE, OSCILLATORIALES) NA MICROCIRCULAÇÃO E EM FIBRAS MUSCULARES: ANÁLISE POR MICROSCOPIA INTRAVITAL.
RESUMO
Geitlerinema amphibium é uma cianobactéria ainda pouco estudada quanto à toxicidade, porém frequente em reservatórios de abastecimento público da Região Metropolitana de São Paulo (Brasil). Estudos recentes mostram que linhagens desta espécie, provenientes da Represa Guarapiranga (São Paulo – Brasil), apresentam toxicidade, quando testadas pelo teste padrão, em camundongo. Entretanto, os sinais apresentados pelos animais intoxicados são distintos daqueles causados pelas cianotoxinas conhecidas até o presente (microcistinas, nodularinas, cilindrospermopsinas, anatoxinas e saxitoxinas), o que sugere a presença de uma nova cianotoxina, cuja natureza química e efeitos são desconhecidos. Devido à freqüência com que G. amphibium é encontrada em reservatórios de abastecimento público, são imprescindíveis, além do estudo químico da toxina em questão, a avaliação de seus efeitos, em mamíferos. Para observar os efeitos induzidos pelo extrato metanólico de G. amphibium “in vivo”, especificamente na microcirculação e em fibras musculares de camundongos, foi empregada a técnica de microscopia intravital. Para tanto, a cepa CCIBT 920 – G. amphibium coletada na Represa Guarapiranga e mantida no Banco de Cultura de Cianobactérias do Núcleo de Pesquisas em Ficologia do Instituto de Botânica de São Paulo foi cultivada sob as seguintes condições: meio ASM-1, temperatura de 23±2oC, irradiância 40 – 50 µmol.fótons.m-2.s-1 e 14 – 10h claro-escuro.
A biomassa, obtida na fase exponencial de crescimento da cultura, foi liofilizada, pesada, extraída com metanol/água 75:25 (v/v) sob a ação de ultra-som e centrifugada (4x). Os sobrenadantes reunidos foram concentrados sob pressão reduzida e esse extrato metanólico seco foi empregado em testes por microscopia intravital. Os animais utilizados nesses ensaios (Camundongos Swiss, com peso entre 19 e 21 g), após serem anestesiados com pentobarbital sódico (Hypnol® Cristália; 50 mg.kg-1), tiveram o músculo cremaster exposto, para observação direta da rede microcirculatória. Nos ensaios prévios, foram avaliados os efeitos de três doses (20, 40 e 120 µg) do extrato metanólico de G. amphibium, administradas topicamente. Posteriormente, foram observados os efeitos de cinco doses [6, 125, 250, 500 e 1000 mg.kg-1 de peso corpóreo (p.c.)], administradas intraperitonealmente (i.p.); para cada dose administrada i.p. foram observados dois períodos de incubação: 30 e 120 minutos.
Como controle negativo, foi utilizada solução salina estéril e para todos os ensaios foram feitas três repetições (n=3). As doses de 20 e 40 µg, administradas topicamente, não causaram alterações na microcirculação ou nas fibras musculares, porém a dose de 120 µg induziu estase venular transitória e depósitos de fibrina em arteríolas, além do aumento do número de leucócitos. As doses de 125 e 250 mg.kg-1 p.c., administradas i.p., nos dois períodos de incubação, foram capazes de induzir aumento do número de leucócitos e estase venular parcial; a dose de 500 mg.kg-1, após período de incubação de 30 minutos, causou estase venular parcial e após período de 120 minutos causou estase venular e arteriolar; a dose de 1000 mg.kg-1 causou estase venular e arteriolar, nos dois períodos de incubação.
Estes resultados mostram que o extrato de G. amphibium possui atividade pró-inflamatória dose e tempo-dependente, sendo que as doses menores (125 e 250 mg.kg-1) causam aumento do número de leucócitos rolantes e estase venular parcial e as doses elevadas (500 e 1000 mg.kg-1), injúria isquêmica. O extrato metanólico de G. amphibium foi submetido a fracionamento por Cromatografia em Camada Delgada em gel de sílica e as frações obtidas foram avaliadas quanto à presença de atividade pró-inflamatória, segundo o mesmo protocolo observado para o estudo do extrato metanólico. Essas frações foram também submetidas a estudos cromatográficos por CLAE e à Espectrometria de Massas (MALDI-MS). Os dados obtidos nesses estudos indicam que a atividade pró- inflamatória apresentada pelo extrato metanólico de G. amphibium deve-se principalmente às substâncias presentes na fração 5, podendo ainda, haver sinergismo entre esta e as frações 3, 4 e 6.
Palavras-chave: Cyanobacteria, Geitlerinema amphibium, intravital, cianotoxinas.
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