Monaly Sado
No dia 29 de setembro de 2009, Monaly Sado , aluna de Pós-Graduação em Biodiversidade Vegetal e Meio Ambiente do Instituto de Botânica (IBt), defendeu sua dissertação de mestrado intitulada “ Efeito do 2,4-D na calogênese de Senna spectabilis (DC) Irwin et Barn (Leguminosae) e seus compostos de reserva”.
A banca examinadora foi composta pelo Dr. Edison Paulo Chu (Orientador/ IBt), Dra. Giuseppina Pace Pereira Lima (Unesp/Botucatu) e Dra. Vivian Tamaki (IBt)
Monaly Sado
Efeito do 2,4-D na calogênese de Senna spectabilis (DC) Irwin et Barn (Leguminosae) e seus compostos de reserva
RESUMO
Senna spectabilis (DC) Irwin et Barn (sin Cassia spectabilis), família Leguminosae, popularmente conhecida como cássia-carnaval, são-joão ou canafístula-de-besouro, é uma árvore ornamental, decídua, heliófita, seletiva xerófita, nativa do Brasil. Atinge entre 6 e 9 metros de altura, apresentando folhas compostas e pinadas, flores amarelas durante os meses de dezembro a abril e frutificação, de agosto a setembro. É muito utilizada na medicina popular para o tratamento de diversas enfermidades e artigos científicos utilizando os extratosS. spectabilis ressaltaram a sua ação antitumoral e anticolinestérica. Grupos de pesquisa isolaram vários alcalóides de estruturas singulares dessa espécie e comprovaram, por meio de bioensaios, que estas substâncias são as responsáveis pelo caráter medicinal da planta e dentre os compostos isolados, destacou-se a espectalina.
Levando em consideração as propriedades farmacológicas desta espécie e a necessidade de um estudo base para o crescimento in vitro da planta, o presente trabalho teve como objetivo desenvolver uma metodologia de propagação vegetativa, identificar a produção de espectalina pelas células multiplicadas in vitro, quantificar os carboidratos (solúveis totais e amido) e proteínas solúveis presentes na indução de explantes em cultura de tecido e correlacionar com as concentrações de 2,4-D exógeno.
Sementes retiradas de frutos maduros de espécime de S. spectabilis proveniente do Instituto de Botânica, São Paulo, após desinfestação com ácido sulfúrico concentrado, foram germinadas in vitro em meio de cultura MS acrescido de vitamina B5, 3% de sacarose, ágar bacteriológico e pH 5,8. As plântulas obtidas tiveram seus órgãos seccionados e inoculados em meio MS contendo a auxina sintética ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D; concentrações de 0,0; 0,12; 0,25; 0,5; 2,5; 5; 10; 20; 40 mg L-1) e mantidas em sala de cultura onde permaneceram até a calogênse. Os calos formados foram classificados (friável, nodular e compacto) e congelados após medida de massa fresca, para posterior liofilização e obtenção de massa seca. Para a extração dos carboidratos solúveis totais foi adicionado etanol 80% ao material seco e homogeneizado. O resíduo foi utilizado para extração de proteínas solúveis adicionando-se tampão fosfato ao mesmo. A extração de amido foi feita adicionando-se ácido perclórico 52% ao resíduo obtido da extração protéica. A quantificação, em triplicata, de amido e carboidratos totais foi realizada pelo método fenol-sulfúrico e os teores de proteínas foram quantificados pelo método do corante Coomassie-Blue. O extrato etanólico concentrado também foi utilizado para identificação de espectalina. O padrão de espectalina foi obtido pela extração etanólica de aproximadamente 500g de massa fresca, congelada, liofilizada e pulverizada de flores de S. spectabilis colhidas no Instituto de Botânica. Os extratos etanólicos foram concentrados, congelados, liofilizados e, após determinação de sua massa seca, os extratos foram hidrolisados com ácido sulfúrico 5% por 16 horas, sendo adicionado hexano para a retirada de lipídeos, e posteriormente as frações ácidas foram basificadas com hidróxido de amônia e realizou-se partição líquido-líquido com diclorometano. A fração de diclorometano foi retirada e evaporada, até atingir seu estado cristalizado, sendo armazenada a 4 ºC. Essa fração de alcalóides foi analisada em cromatógrafo a gás Varian Chrompack CP-3380, com detector de ionização de chama (FID), gás de arraste hélio, e coluna Supelco SPB-1 (30m X 0,25mm), com injeção de 1µl da amostra na concentração de 4,0 mg.ml-1 em acetato de etila.
Os resultados obtidos indicam que o tratamento com 0,12 mg L-1 de 2,4-D induziu calos com melhores condições para realizar estudos de propagação e de desenvolvimento vegetativo pois estes apresentaram maiores concentrações de compostos de reserva. Os calos friáveis do tratamento continham 400 mg g-1 MS de carboidratos solúveis totais, 112 mg g-1 MS de proteínas solúveis totais e 10 mg g-1 MS de amido. Já o tratamento com 0,5 mg L-1 de 2,4-D apresentou calos oxidados com os menores valores de compostos, apresentando 92 mg g-1 MS de carboidratos solúveis, 22 mg g-1 MS de proteínas solúveis e 1,4 mg g-1 MS de amido.
Os hipocótilos e epicótilos produziram maior quantidade de calos quando submetidos ao tratamento com 0,5 mg L-1 de 2,4-D, apresentando acima de 80% de calogênese, já as folhas e cotilédones responderam melhor com 2,5 mg L-1 com 70% de formação de calos e o controle (ausência de auxina) apresentou os menores valores, abaixo de 30% de indução de calos. Os tratamentos de menores concentrações de 2,4-D (0,12; 0,25; 0,5 mg L-1) apresentaram maior incidência de oxidação, com grandes perdas na viabilidade destes explantes.
A produção de espectalina foi observada em quantidade mínima nos diferentes tipos de calos nas diversas concentrações de 2,4-D, exceto em 40 mg L-1 (não detectado), indicando ser um composto secundário possivelmente constitutivo nos calos induzidos, porém inviável para a produção comercial.
Os dados obtidos indicam que um choque de auxina (10 mg L-1 de 2,4-D) em fragmentos de hipocótilo por curto período (máximo de 5 dias) para indução de multiplicação e seu acúmulo de amido, seguido de cultivo com 0,12 mg L-1 de 2,4-D para incremento da massa vegetal e acúmulo dos demais compostos de reserva (carboidratos e proteínas solúveis), possibilita a produção de calos friáveis adequados para o estabelecimento do ciclo de multiplicação da cultura de tecido.
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