Amanda Francine Asega
Amanda Francine Asega, aluna do Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade Vegetal e Meio Ambiente do Instituto de Botânica de São Paulo, defendeu,
no dia 23 de fevereiro de 2007, sua tese de doutorado intitulada:
“Mobilização de frutanos durante a brotação em Vernonia herbacea (Vell.) Rusby:
purificação e expressão gênica de frutano-exohidrolases “.
A banca examinadora foi composta pela sua orientadora Dra. Maria Ângela M. de Carvalho (IBt), Dra. Sônia Machado C. Dietrich (IBt),
Dra. Marília Gaspar Mais (IBt), Dra. Beatriz Rosana Cordenunsi e pela Dra. Rosemeire Aparecida Bom Pessoni.
A mobilização de frutanos durante a brotação em Vernonia herbacea (Vell.) Rusby:
purificação e expressão gênica de frutano-exohidrolases
RESUMO
Vernonia herbacea (Vell.) Rusby é uma espécie nativa do cerrado que apresenta crescimento sazonal e órgãos subterrâneos denominados rizóforos, que acumulam altas concentrações de frutanos do tipo inulina. A enzima responsável pela despolimerização de frutanos é a 1-FEH. A atividade mais elevada desta enzima é detectada principalmente em rizóforos de plantas em brotação natural e de plantas induzidas à brotação pela excisão dos órgãos aéreos. Esta atividade de 1-FEH pode ser ainda intensificada pelo armazenamento no frio das plantas induzidas à brotação. O presente trabalho teve como objetivo estudar a mobilização de frutanos pela ação da FEH durante o processo de brotação. A metodologia utilizada para purificar esta enzima consistiu de precipitação com sulfato de amônio, cromatografia de afinidade em coluna ConA e cromatografia de troca iônica e resultou na separação de diversas frações com atividade de 1-FEH e no isolamento de uma invertase com massa molecular de 60 kDa estimada por SDS-PAGE. As frações obtidas de plantas em fase de brotação natural apresentaram um comportamento diferente em coluna de troca aniônica quando comparado com o das frações obtidas de plantas induzidas à brotação e armazenadas no frio, indicando a presença de diferentes isoformas de 1-FEH em ambas as preparações.
Os resultados obtidos sugeriram que durante o processo de brotação, natural ou induzido, a mobilização de frutanos ocorre por um conjunto de proteínas com atividade hidrolítica que diferem na sua estrutura física e química. Durante este trabalho foram clonadas duas seqüências distintas de FEH obtidas de plantas em fase de brotação, 1-FEH Natural, e de plantas induzidas à brotação e armazenadas a 5°C, 1-FEH Induzida/5 °C. As seqüências foram obtidas por PCR e iPCR, utilizando oligonucleotídeos degenerados e específicos, respectivamente. O seqüência parcial do cDNA da 1-FEH Natural apresentou alta identidade com invertase e com as FEHs de outras espécies, enquanto o cDNA da 1-FEH Induzida/5°C apresentou alta identidade somente com outras FEHs, peso molecular de 65,7 kDa e o pI de 5,32 e algumas modificações pós-traducionais. Este último cDNA foi eficientemente expresso em Pichia pastoris e a proteína recombinante apresentou atividade de 1-FEH.
A atividade e a expressão gênica da FEH e o conteúdo e a composição de frutanos foram analisados em plantas em fase de brotação natural e em plantas induzidas à brotação (Induzidas). Foi avaliado também o efeito da baixa temperatura em plantas induzidas à brotação pela excisão dos ramos aéreos (Induzidas/5°C). A atividade da FEH, os conteúdos de proteína e frutanos foram determinados por colorimetria, a composição dos frutanos por HPAEC/PAD e a análise da expressão gênica por Northern blotting. As variações no conteúdo e na composição de frutanos, na atividade e na expressão gênica de FEH foram detectadas mais significativamente na região proximal dos rizóforos de plantas em fase de brotação natural. A baixa temperatura promoveu o acúmulo de frutanos de baixo GP e intensificou a atividade e a expressão gênica da FEH em plantas induzidas à brotação.
Os resultados sugerem que no processo de brotação natural ocorre uma 1-FEH que hidrolisa fruto-polissacrídeos e _oligossacarídeos indistintamente enquanto no processo de brotação induzida ocorre outra 1-FEH com atividade e expressão gênica intensificadas pelo frio que hidrolisa preferencialmente fruto-polissacarídeos para fornecer energia para o restabelecimento dos órgãos aéreos em plantas Induzidas e para a manutenção dos níveis de fruto-oligossacarídeos em plantas Induzidas/5 °C.
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