Glauciane Danusa Coelho
Glauciane Danusa Coelho, aluna do curso de Pós- Graduação em Biodiversidade Vegetal e Meio Ambiente do Instituto de Botânica, sob a orientação da Dra. Marina Capelari (IBt), defendeu em 26 de setembro de 2007 sua Tese de Doutorado, intitulada
” Purificação parcial do sistema enzimático produzido por Psilocybe castanella CCB444 durante crescimento em solo “.
A banca examinadora foi composta por: Dra. Marina Capelari, (orientadora – IBt), Dr. Dácio Roberto Matheus (IBt),
Dra. Iracema Schoenlein-Crusius (IBt), Dra. Adriana Florentino de Souza Leoni (UniSantos) e Dr. Jonas Contiero (externo).
Purificação parcial do sistema enzimático produzido por
Psilocybe castanella CCB444 durante crescimento em solo
RESUMO
Psilocybe castanella CCB444, com capacidade comprovada de mineralizar pentaclorofenol e hexaclorobenzeno, foi avaliado em processo de biorremediação de solo contaminado com organoclorados. Este trabalho descreve a identificação da principal enzima ligninolítica, lacase, produzida por este fungo, purificação parcial e caracterização, bem como a avaliação da capacidade dessa enzima em de degradar o pentaclorofenol (PCP) in vitro. Atividade de lacase foi detectada durante crescimento de P. castanella em solo acrescido de gesso, tween 20 e óleo vegetal, aos 19 dias de cultivo. O extrato enzimático extracelular foi obtido com tampão acetato de sódio 50 mM pH 4,5 (1:3 m/v). Para a purificação parcial da lacase foram empregados os processos de precipitação de proteínas com 90% de saturação de sulfato de amônio, clarificação (PVPP 4%), ultrafiltração (10KDa) e cromatografia de exclusão molecular (Sephadex G-200). A reação de degradação do PCP incluiu, a lacase purificada do na concentração de 7,5 UL-1, tampão acetato de sódio, água e solução de PCP diluído em etanol. A mistura de reação foi incubada no escuro durante 24h. A quantificação do PCP foi determinada por HPLC. A eficiência da enzima foi avaliada em diferentes concentrações de PCP, valores de pH e presença de substâncias inibidoras e mediadoras. A massa molecular da enzima foi estimada em 64 KDa, o Km aparente foi de 4,6 mM e a Vmax de 11,16 UL-1. Os valores de temperatura e pH ótimos foram de 50ºC e 2,5, respectivamente. A lacase apresentou-se estável a temperatura ambiente, mantendo 96% de atividade após 24 h de incubação. Meia-vidas de 19 h, 17 h e 47 min foram verificadas a 55°C, 60ºC e 80°C, respectivamente. A atividade enzimática foi inibida totalmente pela adição de azida sódica e sulfato de ferro II e estimulada pelo sulfato de cobre II e de manganês II. As maiores porcentagens de degradação do PCP foram obtidas nas concentrações de 100 e de 150 µg/mL de PCP e em pH 3,5. Substâncias como o ABTS e RBBR, conhecidas por serem mediadores de lacase, não favoreceram a degradação do PCP, enquanto o cloreto de ferro e o sulfato de ferro inibiram completamente a transformação do PCP pela lacase.
Palavras-chaves: purificação de lacase, enzima ligninolítica, basidiomicetos, Psilocybe castanella, degradação in vitro
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